【前言】

小細胞外囊泡（sEVs）是由幾乎所有細胞類型釋放的脂質膜包裹的納米顆粒，通常範圍從20到200納米，通過傳遞各種信號分子和細胞成分（如蛋白質、脂質、核酸和代謝物）在細胞間通信中發揮關鍵作用。小細胞外囊泡（sEVs）作為無細胞治療的新方向，在疾病治療中展現出巨大潛力。然而，使用sEVs作為疾病治療劑的普及受到來源細胞增殖潛力的限制，特別是如果親本細胞壽命有限，從臨床前測試到臨床應用，規模化工藝是一大難點。

細胞工藝培養方式主要分為二維（2D）培養和三維（3D）培養。3D培養更真實地再現了細胞與細胞之間以及細胞與胞外基質之間地相互作用，更準確地模擬細胞在組織中的實際微環境。且3D培養方式更易於規模化生產，可實現產業化。

        細胞貼附在3D TableTrix® 微載體上進行三維培養

與傳統的二維（2D）細胞培養相比，三維（3D）培養系統可以使MSC處於代謝有利的狀態，從而提高增殖活性、幹細胞特性、旁分泌功能以及衰老和凋亡的保護。已有相關文獻證明3D培養可以增強細胞分泌小細胞外囊泡（sEVs）。然而，驅動sEV分泌並影響其治療疾病潛力的分子機制尚未闡明。

近日，Journal of Extracellular Vesicles（IF=14.5）在線發表了一篇題為「Cortical Actin Depolymerisation in 3D Cell Culture Enhances Extracellular Vesicle Secretion and Therapeutic Effects」的研究論文，該研究首次闡明3D培養通過ITGA1/RhoA/cofilin依賴的肌動蛋白解聚增強sEV分泌及治療功能的新機制，該機制獨立於經典的Rab27A/B通路。這一發現為幹細胞來源sEV的規模化生產與臨床轉化提供理論依據。

原文連結：http://isevjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jev2.70109

【研究背景】

當前的研究，3D培養方式主要包括複合聚合物支架培養、微球靜態培養、生物反應器動態培養等方式。其中，3D細胞培養系統---生物反應器和細胞球體，已成為大規模EV生產的平台，提供反映體內生理條件和機械刺激的3D環境，以增強細胞反應和EV分泌。

3D FloTrix® miniSPINFLEX生物反應器

該研究通過將MSCs加載到微載體上並在3D旋轉瓶生物反應器中培養這些構建體，創建了3D培養條件。對比2D培養條件，3D FloTrix® miniSPIN FLEX生物反應器動態培養方式對sEVs分泌和疾病治療效果的影響，為幹細胞來源sEV的規模化生產與臨床轉化提供理論依據。

【研究設計】

研究採用3D FloTrix® miniSPIN FLEX生物反應器培養MSCs，在體外細胞模型中，檢測sEVs在不同培養系統中分泌的效果、細胞增殖能力、細胞癒合能力以及對巨噬細胞的極化影響。在體內動物模型中，驗證3D培養的sEVs對骨關節炎（OA）和大鼠傷口癒合等疾病的處理效果。

【研究內容】

▲A. 3D增殖能力強：MSC-2D在3天後停止增殖，而MSC-3D在7天內繼續增殖；

▲B. 3D-sEVs產量高：MSC3D-sEVs的產量大約是MSC2D-sEVs的2.5倍；

▲C. 3D衰老比例低：與MSC-2D相比，MSC-3D的衰老細胞比例明顯較低；

▲D. 3D凋亡比例低：與MSC-2D相比，MSC-3D的凋亡細胞的比例明顯較低；

▲E. 3D-sEVs改善骨關節炎：與MSC2D-sEVs組相比，MSC3D -sEVs組軟骨表面更光滑；

▲F. 3D-sEVs加速傷口癒合：與其他組比較，MSC3D-sEVs組顯示出所有組中最快的傷口癒合率。

【研究結論】

研究採用3D FloTrix® miniSPIN FLEX生物反應器培養MSCs，結合基因敲低、免疫熒光及動物模型等方法，發現3D培養通過下調整合素α1（ITGA1）抑制RhoA/cofilin信號通路，誘導皮質肌動蛋白解聚，解除其對多囊泡體與細胞膜融合的物理屏障，使sEV分泌量提升2.5倍，並且證實3D培養的調控機制獨立於Rab27A/B。

功能驗證顯示，3D培養的sEVs（MSC3D-sEVs）在體外可促進軟骨細胞/成纖維細胞增殖遷移、抑制細胞衰老，並誘導巨噬細胞向抗炎M2型極化；在大鼠骨關節炎和傷口癒合模型中，MSC3D-sEVs顯著改善關節間隙、加速傷口癒合，為骨關節炎、組織損傷等慢性疾病的無細胞治療提供了從機制到應用的可轉化技術路徑，為sEV規模化生產與臨床轉化奠定了理論基礎。

【研究應用材料及設備】

① 更仿生：由數萬顆彈性三維多孔微載體組成，孔隙率>90%，粒徑大小可控於50-500μm區間， 均一度≤100μm，形成真正的3D仿生培養。 ② 資質全：該產品已獲得2項CDE藥用輔料資質，登記號為【F20200000496；F20210000003】，3項FDA原料藥及藥用輔料資質，登記號為【DMF：037798、035481；MF：29721】 ③ 易收穫：特異性降解技術裂解微載體，收穫相較於傳統方式更高效更溫和。 ④ 更安全：擁有權威機構出具的裂解殘留檢測、細胞毒性、熱原反應、遺傳毒性、體內免疫毒理學相關質量評價報告以及溶血性、皮下注射局部刺激性、主動全身過敏性、腹腔注射給藥毒性等安全性評價報告。 ⑤ 易放大：通過3D培養方式，結合韦德国际生物3D細胞智造平台全線產品可以實現全自動封閉式大規模細胞培養，實現千億量級細胞收穫。 ⑥ 更優質：通過3D多孔可降解微載體+ 動態培養技術，進行三維培養，優勢顯著——培養細胞體積更小、遷徙能力更強，同時具備更卓越的免疫調節和組織修復潛能。

① 超薄設計：超薄主機高度僅48mm，扁平化設計可進一步提高培養箱空間利用率。 ② 不鏽鋼機身：主機採用全不鏽鋼設計，易清潔好擦拭，滿足潔淨需求。 ③ 適配一次性反應瓶：適配韦德国际自研透氣內置葉輪一次性反應瓶。其中，搭配125/250ml透氣內置葉輪一次性反應瓶，可在一台170L培養箱放置2台設備，實現共8個瓶位的培養體系。 ④ 同步關聯：開啟關聯功能，並結合配方工藝的使用，可將多個瓶位統一工藝模式，一鍵操作即可實現多瓶位同步啟動/暫停/停止，高效完成對照試驗。 各瓶位間也可任意關聯操作，如圖示：瓶位1、瓶位2、瓶位3使用工藝一關聯，達到三個瓶位同步運行的效果。 ⑤ 工藝預設：配備十種配方工藝和四種自定義工藝，共計兩類步驟模式，滿足多步驟、多循環工藝需求。 參數可修改，斷電可保存，單步驟時間最高可達1000min,循環次數高達100次，操作便捷。 ⑥ 可編程工藝：攪拌程序可編程、參數自定義。滿足間速模式／雙速模式／間恆速模式不同工藝需求，實現工藝條件的探索和優化。 ⑦ 雙語系統：系統支持中英文雙語，一鍵切換，靈活便捷。 ⑧ 實時信息：系統實時顯示每個瓶位的工藝參數：時間、轉速、工藝、步驟等。

【關於韦德国际】

北京韦德国际生物科技有限公司成立於2018年，由清華大學生物工程學院杜亞楠教授科研團隊領銜創建，清華大學參股共建。核心技術源於清華大學科技成果轉化，並憑藉此項技術榮登中國科協「科創中國」先導技術榜。作為國家級高新技術企業、國家級專精特新「小巨人」企業、潛在獨角獸企業，更獲得國家科技部多項重點研發專項支持。

作為高質量三維細胞製造專家，韦德国际生物提供基於3D微載體的一站式定製化細胞規模化擴增整體解決方案，打造了原創3D細胞智造平台，實現規模化、自動化、智能化、密閉式的細胞藥物及其衍生品生產製備，以此幫助全球客戶建立最為先進的細胞藥物生產線。在開創【百億量級】幹細胞製備工藝管線後，加速向【千億量級】進發，致力於以3D細胞規模化智造技術賦能細胞與基因治療產業，惠及更多患者。