由於高度增殖和分化能力，幹細胞在人類醫學中具有巨大的應用潛力。所以正如當前臨床前和臨床研究表明，它毋庸置疑地被廣泛用於一系列醫療應用中，如針對骨骼和軟骨再生、治療心肌、糖尿病治療、脊髓損傷修復等，甚至有助於減緩整體衰老過程。但是，要保持所需的數量的細胞質量一致，目前急需一種可以替代目前的2D平面模式培養方案，利用攪拌式生物反應器進行脂肪組織和骨髓來源的 hMSC生長在固體或多孔微載體上已被證明適用於台式和中試規模 。

這對於一次性生物反應器來說情況尤其如此 ，其主要優點是能夠提供較高的工藝安全性和靈活性。因此，如何設計一款合適的生物反應器保證與2D培養模式獲得相同甚至更優異的擴增倍數及分化效果成為目前主流的課題，本篇文章主要從產品設計及工藝角度評估與優化幹細胞微載體形式培養工藝，旨在提高幹細胞培養效果。

【攪拌槳槳葉設計對幹細胞培養的影響評估】

攪拌槳槳葉設計對於幹細胞微載體形式培養具有顯著影響，尤其是對於微載體懸浮及細胞培養剪切力的影響。Elephant Ear型攪拌槳因為採用斜槳設計，同時在轉動時帶來流體在水平及軸向兩個方向的流動，因此具有混合效果好及剪切力小的優點，通常適用於包括哺乳動物細胞及幹細胞的細胞培養（如圖1）。

圖1：Elephant Ear 槳葉示意圖

Elephant Ear型攪拌槳目前有多種角度形式的設計，經過水平方向30度、45度及60度角度設計對比發現，30度攪拌槳雖具有較低的剪切速率，但其軸徑向流運動分佈較差，不利於營養物質的快速傳質及微載體等顆粒物的懸浮；而60度攪拌槳設計則與之相反，軸徑向流運動分佈較佳，但剪切速率非常高，對於細胞培養容易造成損傷風險；相比之下，45度槳葉相較於其他兩種類型具有較低的剪切率範圍及相對較均勻的速度分佈（如圖2），有利於營養物質的傳遞及較低的微載體及細胞損傷風險，使之非常適合於微載體懸浮。

圖2：槳葉角度與位置設計軸向流速度分佈展示圖

此外，槳葉的安裝位置同樣會影響流體循環及動力消耗，如果槳葉安裝過低，會使流體還沒有達到液面就發生轉向，減低循環效率，同時會造成細胞及微載體撞擊罐體底面損傷細胞形成「研磨效應」；如果槳葉安裝過高，則底部產生的循環流動很小，造成錐形死區面積較大，循環效果變差，因此為了良好的循環流動狀態及微載體懸浮效果，需要對攪拌槳位置進行優化，以進一步減少罐底錐形導流區並有效降低微載體懸浮的攪拌速率（圖3），從而降低剪切速率，有效提高細胞培養密度及活率。實驗表明，槳葉經過30度調整至45度及位置優化設計進行的MSC間充質幹細胞的微載體懸浮培養工藝可較相同條件下的反應器培養密度提高到2.4倍以上。

攪拌槳組數、組合及分佈對細胞培養同樣存在影響。通常較大規模細胞培養採用雙層槳結構設計，該類型結構中攪拌槳相對位置及攪拌槳組合形式均會影響細胞培養過程中的氣含率、功率消耗和氣液傳質性能。

Elephant Ear攪拌槳為軸流槳，對底槳的剪切應力分佈影響較小，雙層Elephant ear槳葉合理位置分佈能改善流速不均並抑制局部渦流的形成，實現槳葉間較強的流場聯動。採用不同組合方式時，由於槳與槳之間可存在局部渦流，導致流體速度分佈不均，造成槳葉間流場的接連作用減弱，或頂槳排出流體對底層槳葉產生較大的衝擊作用，導致底層槳的平均剪切應力有所減小，因此需要選擇合理的槳葉搭配與槳間距離來改善較優的流速分佈。此外，由於大部分氣相滯留和氣液傳質發生在底層槳附近，可採用較大功率准數的底層槳來實現較好的氣泡剪切作用及分散滯留效果，從而增加氧傳質效果；頂槳周圍的氣含率相對較小，因此可以選擇具有較小功率准數的軸流槳來降低功耗，並同時強化大循環流結構對氣泡的滯留作用與氣液傳質能力。

圖3：標準槳葉與優化後微載體最低懸浮轉速Njs（淺藍）與最低底部移動所需速度Ns1u（深藍）對比

【適合於幹細胞培養的攪拌速率的確定】

反應器攪拌速率對於幹細胞培養具有重要的影響和作用，常見的間充質幹細胞MSC因需貼附於微載體上進行培養，故需要通過優化攪拌槳轉速實現微載體懸浮及混勻效果，並有效降低剪切力影響。微載體懸浮培養常用的臨界轉速Njs可用於評估微載體等顆粒離底懸浮所需的最低轉速。Njs轉速可確保微載體在罐體底部存留時間不超過2秒鐘。在缺乏S常數的情況下，Njs值通常可採用某一微載體濃度下經驗測定S值並應用於預測其他微載體濃度下的攪拌速度。

微載體Njs懸浮速度與溶液粘度、微載體-溶液密度差、投放微載體濃度及微載體直徑成正比關係，與攪拌槳直徑成反比關係，因此從設計角度出發，採用較大槳葉的設計有助於實現較低的攪拌速度及可實現微載體的懸浮，從而減少剪切力對微載體及細胞的影響。

S: 茲維特林 Njs 常數 , 

υ: 運動粘度(m2/s), 

g: 重力常數(m/s2),

s: 固態物質密度(kg/m3), l

l: 溶液密度(kg/m3), 

X: 裝載固體濃度((kg 固體/kg 液體) × 100), 

dp: 顆粒物直徑(m), 

D: 攪拌槳葉直徑(m).

在幹細胞的微載體懸浮培養過程中，細胞及微載體同樣容易受到培養條件中較高攪拌速度下形成的渦流的影響，造成細胞脫落或損傷以及微載體的損壞，因此對於幹細胞的微載體懸浮培養工藝，攪拌速度上限需要明確限定以保證培養的成功率。渦流的影響由Kolmogorov渦流尺寸作為評判標準評估，通常Kolmogorov渦流尺寸低於細胞及微載體直徑的2/3會對細胞及微載體造成損傷，因此，需要保證Kolmogorov渦流尺寸大於該標準，此時相應的攪拌速度可以定義為Nk。例如，微載體直徑為200um左右，Kolmogorov渦流尺寸要求不高於133um，以降低潛在的細胞損傷影響。

圖4：微載體懸浮培養工藝攪拌轉速可操作區間示意

攪拌槳組數、組合及分佈對細胞培養同樣存在影響。通常較大規模細胞培養採用雙層槳結構設計，該類型結構中攪拌槳相對位置及攪拌槳組合形式均會影響細胞培養過程中的氣含率、功率消耗和氣液傳質性能。

λk: Kolmogorov 渦流尺寸 (m), 

υ: 溶液運動粘度 (m2/s), 

εT: 動能耗散率 (W/kg), 

Np: 攪拌槳功率准數, 

N: 攪拌槳轉速 (rps), 

D: 攪拌槳直徑 (m), 

V: 溶液工作體積 (m3).

基於以上分析，反應器中某一濃度下微載體含量的攪拌速度上下限即可通過Njs與Nk來限定，即Njs<n<n< span="">k（如圖4）。需要指出的是，在培養過程中，細胞在微載體表面的增殖會影響微載體直徑的變化，因此在實際培養過程中需要充分評估，可適當增大攪拌速度以抵消該影響。

生物反應器培養已成為幹細胞產業化培養的關鍵工具，對於生物反應器的設計，可綜合攪拌槳葉類型、角度及直徑大小以及槳葉組合的方式並進行充分優化，最終達到溫和的幹細胞培養環境，並最終實現較高的擴增倍數、活率及分化效果。

【參考文獻】

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