前言

由於關節軟骨結構特殊，其自我修復能力有限。無論損傷是創傷性還是疾病誘發的，軟骨組織都會引發炎症變化，例如釋放腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）和趨化因子等炎症介質。此外，它們還會促進基質降解酶（如基質金屬蛋白酶（MMPs）和解聚蛋白樣金屬蛋白酶（ADAMTS）家族）的增加。這些酶不僅破壞細胞外基質（ECM）的結構，還會產生降解產物，這些產物引發更強的炎症反應，並顺利获得膠原蛋白和蛋白聚糖成分的丟失促進ECM的逐漸降解。這影響了一系列細胞和基質的功能，並導致軟骨下骨損傷，從而形成骨贅。

在再生醫學中，傳統的支架植入通常需要大的手術切口，並伴有疼痛和感染等併發症的風險。然而，微組織的微創植入可以避免這些問題，並能夠靈活修復形狀不規則的軟骨缺損。微組織是能模擬靶器官或組織功能的微小組織團簇。單獨使用細胞構建微組織常導致壞死核心形成。然而，天然軟骨的ECM既能给予結構支撐，又是微載體的理想來源。

ECM脫細胞能夠去除細胞成分和其他抗原性物質，這降低了炎症反應和免疫排斥的風險，同時保留了ECM的生物、機械和生化特性。因此，脫細胞ECM可以作為細胞接種的可靠三維（3D）載體。

近期，Materials Today Bio【IF：10.2】在線發表了一篇題為「High paracrine activity of hADSCs cartilage microtissues inhibits extracellular matrix degradation and promotes cartilage regeneration」的研究文章，該文章顺利获得3D FloTrix® MicroSPIN 6通道攪拌旋轉式生物反應器構建的ADSCs微組織（ADSCs-MT）實現了優異的軟骨再生效果，有望有助于軟骨微組織的自體應用。

原文連結：http://doi.org/10.1016/j.mtbio.2024.101372

  研究背景

組織工程通常顺利获得再細胞化實現支架的再增殖，因此需要具有特定結構和功能的構建體。幹細胞因其強大的增殖和分化能力而被廣泛用於再細胞化。在此類幹細胞中，胚胎幹細胞（ESCs）和誘導多能幹細胞（iPSCs）表現出最大的生長和分化潛力。然而，它們的使用涉及倫理問題，並且它們向特定細胞譜系的分化相當耗時。相比之下，間充質幹細胞（MSCs）因其優異的免疫特性和軟骨分化能力而被廣泛應用於軟骨組織工程。此外，與軟骨細胞相比，MSCs可以顺利获得侵入性較小的程序自體獲取。雖然同種異體MSCs理論上降低了免疫排斥的風險，但研究表明，它們的存活率顯著低於自體MSCs，並且可以促進具有記憶表型的T細胞產生。

在本研究利用兩種主要的同一個體MSCs來源——脂肪來源幹細胞（ADSCs）和骨髓來源幹細胞（BMSCs）——來構建微組織並進行系統比較。ADSCs和BMSCs都易於顺利获得符合倫理的方式獲取，並且它們的應用前景已得到充分驗證。BMSCs是組織工程中最早使用的MSCs，可以分化成多種組織。然而，ADSCs更容易從皮下脂肪中大量獲取，在軟骨修復中也顯示出顯著的再生優勢，造成的損傷更小。值得注意的是，ADSCs和BMSCs的再生潛力可能因支架和治療環境而異。儘管許多研究已探討了這兩種細胞的軟骨形成能力，但在微組織構建背景下對它們進行系統評估和比較的研究相當有限。因此，比較ADSCs和BMSCs在微組織中的表現對於推進其臨床應用至關重要。

▲圖1 ：3D FloTrix® microSPIN 6通道微型生物反應器

本研究製備了微載體，並比較了兩種同源細胞在微載體環境中的行為特徵。微載體微環境凸顯了ADSCs的優勢，顯著促進了該細胞的增殖與遷移。隨後顺利获得3D FloTrix® MicroSPIN 6通道攪拌旋轉式生物反應器構建了ADSCs微組織（ADSCs-MT）與BMSCs微組織（BMSCs-MT）。體內外實驗證實ADSCs-MT的軟骨再生能力顯著優於BMSCs-MT。轉錄組學分析表明ADSCs-MT中ECM降解、成骨分化及纖維軟骨標誌物的表達水平顯著降低。最終驗證了微組織對炎症軟骨細胞的保護作用。本研究構建的ADSCs-MT實現了優異的軟骨再生效果，有望有助于軟骨微組織的自體應用。

研究設計

▲圖 2 ：整體研究設計圖

示意圖展示利用cECM微載體製備ADSCs-MT與BMSCs-MT的過程，以及顺利获得成軟骨誘導的ADSCs-MT實現軟骨再生的體內外驗證實驗。

  研究內容

在實驗前期製備了軟骨來源的脫細胞細胞外基質（cECM）及其微載體的基礎上，顺利获得3D FloTrix® MicroSPIN 6通道攪拌旋轉式生物反應器構建ADSCs-MT與BMSCs-MT並進行相關評估。

▲圖 3 ：體外評估ADSCs-MT與BMSCs-MT

(A) 微組織製備流程示意圖。

(B) 微組織製備關鍵時間點圖像。

(C) 微組織掃描電鏡（SEM）微觀形貌觀察。

(D) 兩組微組織中SOX9、COL2及ACAN的mRNA表達水平。

(E) 兩組微組織SOX9蛋白免疫熒光檢測。

(F) SOX9蛋白表達定量分析。

(G) 兩組微組織COL2與ACAN蛋白的Western blot分析。

(H) 微組織H&E染色與甲苯胺藍染色結果。

(I) 三種趨化梯度下的Transwell細胞遷移實驗。

進一步比較脂肪源性幹細胞微組織(ADSCs-MT)與骨髓間充質幹細胞微組織(BMSCs-MT)的基因表達及調控通路差異，對兩種微組織分化後進行了mRNA-seq分析。

▲圖 4 ：兩組微組織中mRNA測序及差異表達基因(DEG)分析

(A)兩組微組織表達基因的維恩圖。

(B)兩組微組織RNA測序數據的火山圖。

(C)差異表達基因熱圖。

(D)差異表達基因的GO富集分析。

(E)差異表達基因的KEGG富集分析。

為深入探究ADSCs-MT細胞的發育與分化進程，在培養關鍵時間點（第0天、第7天和第14天）對ADSCs-MT進行了RNA測序。

▲圖 5 ：在hADSCs-MT培養過程中的關鍵時間點進行mRNA測序和差異表達基因（DEG）分析

（A）ADSCs-MT在D0、D7和D14天表達基因的維恩圖。

（B）差異表達基因熱圖。

（C、F、I、L）D7與D0比較的火山圖、GO富集分析、KEGG分析和差異表達基因PCR驗證。

（D、G、J、M）D14與D0比較的火山圖、GO富集分析、KEGG分析和差異表達基因PCR驗證。

（E、H、K、N）D14與D7比較的火山圖、GO富集分析、KEGG分析和差異表達基因PCR驗證。

ADSCs-MT展現出更強的旁分泌效應，並具有軟骨保護特性。

▲圖 6 ：ADSCs-MT發揮軟骨保護作用

(A)用於微組織與人軟骨細胞共培養的Transwell系統示意圖。

(B)各組軟骨細胞中基質形成相關基因(COL2和ACAN)與基質降解相關基因(MMP1、MMP13、ADAMTS4和ADAMTS5)的相對表達量。

(C)各組軟骨細胞中COL2和ACAN的蛋白表達。

(D)COL2和ACAN蛋白表達的定量分析。

(E)MMP13的免疫熒光分析。

(F)基於免疫熒光檢測的MMP13蛋白表達分析。

基於宏觀評估、組織學染色和免疫熒光染色，考察了裸鼠皮下植入不同微組織8周後的組織再生情況。

▲圖 7 ：裸鼠皮下植入8周後再生組織評估

(A)各組裸鼠皮下植入8周後再生組織大體觀。

(B)蘇木精-伊紅染色。

(C)甲苯胺藍染色。

(D)番紅O染色。

(E)COL2免疫組化染色。

(F)COL1免疫組化染色。

(G)SOX9免疫熒光染色

  研究結論

本研究將同源ADSCs與BMSCs分別與細胞外基質（cECM）微載體結合，在三維動態培養環境中構建了ADSCs-MT和BMSCs-MT微組織。顺利获得體外與體內實驗對兩類微組織進行系統評估，結果表明ADSCs-MT具有優異的軟骨分化能力和強大的旁分泌特性，能有效保護炎症環境中的軟骨細胞，並在體內促進高質量軟骨組織的再生。本研究為微組織構建及有效促進軟骨再生给予了新的見解與證據。

研究應用材料及設備

① 六位平行：可同時進行6種工藝條件探索驗證，極大縮短研發周期。

② 多模式攪拌：循環攪拌，勻速攪拌，間速攪拌。

③ 十種工藝編程：可預設十種工藝，實現一鍵操作，便捷高效。

④ 自定義多孔位聯動：支持孔位關聯功能，實現平行過程控制。

⑤ 高精度控制：轉速最小穩態誤差控制在±1 rpm以內，保證實驗結果穩定性。

⑥ 抗磁場干擾技術：自主研發的抗磁場干擾技術，使每個孔位運行時互不干擾。

⑦ 複合散熱設計：高導熱材質，獨立散熱風道，維持細胞生長穩態環境。

⑧ 迷你機型：整體高度僅75 mm，佔用體積0.05 m³，一台170 L培養箱可放置4台microSPIN反應器，可同時進行24組對照實驗。

⑨ 人性化設計：扁平數據線設計，更易從夾縫中穿出；30度傾角視窗設計，便於站立觀察。

作者簡介

第一作者：劉偉，女，山東第一醫科大學 ( 山東省醫學科學院 )與解放軍總醫院聯合培養碩士，主要從事軟骨損傷和組織工程修復研究。

通訊作者：亓建洪教授，山東第一醫科大學 ( 山東省醫學科學院 ) 運動醫學與康復學院 ，主任醫師，博士生導師。

通訊作者：彭江教授，中國人民解放軍總醫院骨科醫學部研究所所長，全軍骨科戰創傷重點實驗室主任，主任醫師，博士生導師。

通訊作者：汪愛媛教授，中國人民解放軍總醫院骨科醫學部研究所，研究員。長期從事骨軟骨組織工程技術基礎及臨床轉化研究。

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